细胞培养试剂和分析

概述

什么是细胞培养？

细胞培养定义为：将细胞从其天然环境取出并置入实验室中适宜的体外环境供进一步研究。这是一项遍及细胞生物学研究领域的必需技术。细胞培养的成功取决于用以下要素优化培养条件：(1) 适宜水平的气体（O₂、CO₂）、pH 值、压力和温度，(2) 提供所需营养素、矿物质、盐和氨基酸的合适培养基，(3) 维持表型和整体细胞健康的有效生长因子，(4) 用于贴壁细胞培养的适当细胞贴壁基材。

液体细胞培养基是否可以冷冻？

不建议冷冻液体细胞培养基，原因在于以下事实：冷冻通常导致不溶性盐复合物析出和形成。

在我加热灭活血清后，可见一些沉淀物，为何如此？

热灭活的血清（包括胎牛血清 [FBS]） 可能含有一些浑浊、絮状物或晶态沉淀物。这是血清产品的正常现象，而无论如何不表示产品质量受损。通常，这种物质由血清中的纤维蛋白组成，纤维蛋白从可溶性纤维蛋白前体——纤维蛋白原转化而来。Bio-Techne 在低温快速收集并处理所有血清，以产出生长性能出色的优质血清。这种速冷处理引起一些可溶性纤维蛋白原在过滤后保留于血清中，一旦解冻，这些可溶性纤维蛋白原可能转化为纤维蛋白。在血清中发现的沉淀物通常还含有血清无机组分和蛋白质的钙复合物。血清脂质组分也可能导致血清产品浑浊。解冻不正确、冻融循环频繁、热灭活以及在高于冷冻的温度储存延长将导致量更多的沉淀物。血清用作细胞培养的生长补充剂时，血清中存在沉淀物并不改变产品的性能特征。不建议过滤血清移除这些沉淀物。这么做可能导致血清某些营养素丢失，并且可能堵塞滤器。然而，如果需要移除絮状物，建议在无菌管中按 400 x g 短暂离心血清。

我应当如何解冻血清，以确保性能不受影响？

冷冻的血清应快速解冻，以避免血清营养素在解冻时段期间长时间暴露在较高的盐浓度。在室温或在 37°C 水浴中解冻冷冻的血清。解冻过程期间，定期摇动血清瓶以重悬粘稠溶质并避免盐梯度、蛋白质梯度和脂质梯度形成，这些梯度可能导致过度沉淀。血清完全解冻时，尽快从水浴中迅速取出血清。将解冻的血清在添加至培养基或热灭活之前彻底混合。不建议在高于 37°C 的温度解冻血清，这种方法可能降解热不稳定性营养素，进而损害产品的完整性和性能，并可能导致沉淀物形成增加。

你们建议采用什么程序冷冻血清？

应尽可能迅速冷冻血清，包括 FBS，以避免血清营养素长时间暴露于较高的盐浓度。水是首先冷冻的血清组分，这导致诸如蛋白质和盐等其他血清组分以较高浓度积聚在容器底部。因此，缓慢冷冻将会导致晶态沉淀物过度形成。

血清是否对光敏感？

血清含有受光暴露影响的组分。但是，在室内光线下正常处理血清几乎不影响血清。光对血清的影响将取决于光强度、光波长和暴露时长。因此，应避免高强度光及在光下长期储存。请注意，相比其他细胞系，某些细胞系可能更敏感于光对血清的影响。

血清为何热灭活？

一般而言，热灭活的目的是破坏血清的补体活性，但不影响血清的促生长特性。对于大多数细胞培养物而言，不要求从血清中消除补体活性，但如果培养物对补体活性敏感，则可能需要消除。由于热灭活血清可能某种程度上降低血清的生长性能属性，因此这种规程仅应在确实要求最佳细胞生长时才进行。如果需要热灭活，应小心控制这个过程，以避免血清蛋白质变性增加和晶态沉淀物形成增加，这可能导致生长性能过度损失。最初，热灭活也用于灭活微生物性污染物如支原体。无需为此原因进行热灭活，原因是 Bio-Techne FBS 经过三次 0.1 μm 过滤并且所有其他 Bio-Techne 生产的血清均必须为支原体、细菌和真菌检测阴性。有时，执行热灭活以破坏敏感病毒。在这种应用的大部分实验方案中，需要延长的热灭活。不建议这样做，原因是这种处理导致血清的宝贵组分失效。

为什么有些细胞培养基含有丙酮酸钠？

人们将丙酮酸钠加入许多低糖和高糖 DMEM 配方中。细胞可以利用丙酮酸钠作为轻易可获得的碳源，用于能量生成和其他关键代谢途径，绕过从葡萄糖或氨基酸中生物合成方式产生它的必要。一些细胞系要求向培养基添加丙酮酸，原因是这些细胞系缺乏将葡萄糖或氨基酸转化为丙酮酸的能力。

为何存在血清批间变异性？

胎牛血清和其他血清产品含有复杂的生物组分混合物，其中大多数尚未完全确定。这些血清组分的组成天然地存在批间差异。您的理想血清批次是在您的具体应用中对细胞有效的血清。Bio-Techne 拥有 40 年在市场上提供一些非常一致血清的经验史 。我们可以通过提供各种旨在最大限度减少血清变异性对客户影响的计划，如批次匹配、免费样品供批次预认证、批次预订延长和免费现场血清储存，从而帮助您选择适合您应用的血清批次。

胞外基质组分

层粘连蛋白 I 是什么？

层粘连蛋白 I 是胞外基质的主要组分。Cultrex 层粘连蛋白 I 纯化自 EHS 小鼠肉瘤。 它由 α1β1γ1 链组成，总分子量为 800,000 Da。Cultrex 层粘连蛋白 I 增加细胞黏附、迁移、生长、分化、神经突长出、蛋白酶产生和恶性度。反应取决于细胞类型。

Cultrex 层粘连蛋白 I 的建议工作浓度是多少？

用于薄涂覆的建议工作浓度为 0.05-10 µg/cm²。但是， 必须针对每个细胞系或模型优化条件。对于 3D 培养应用，Cultrex 层粘连蛋白 I 应按 6 mg/mL 使用。

Cultrex 小鼠层粘连蛋白 I 能否用于玻璃盖玻片上？

用 Cultrex 层粘连蛋白 I 涂覆玻璃盖玻片是相当常见的并已被发表。

基底膜提取物

什么是基底膜提取物？

Cultrex  基底膜提取物是从 Englebreth-Holm-Swarm (EHS) 肿瘤纯化的可溶性胞外基质。这些基质在 37°C 聚合以形成重构的基底膜，这些基底膜富含胞外基质蛋白，如层粘连蛋白、胶原蛋白 IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。这些专化的胞外基质片材为细胞提供结构性支撑，并通过影响细胞黏附、增殖、迁移和分化，在建立组织架构中发挥重要作用。

哪些类型的肿瘤细胞或活检标本配合 Cultrex BME 在体内生长？

已发现多种细胞系和肿瘤活检标本（通常切成小碎片）随 Cultrex BME 一起植入时在体内生长。这些包括黑色素瘤、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和肝癌，以及 3T3 小鼠胚胎成纤维细胞系。

我应将哪种基质用于 3D 培养或研究侵袭？

基质选择应与您想要重现的环境相对应。Cultrex  基底膜提取物将重现基底层，后者为大多数上皮源或内皮源细胞奠定基础。Cultrex  层粘连蛋白 I 是结缔组织的主要组分，并且通常栖居有不动性细胞（如纤维细胞和脂肪细胞）以及迁移性细胞（如肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜酸粒细胞）。

非致瘤性细胞/组织在 Cultrex 基底膜提取物中体内植入时将如何生长或分化？

已发现与 Cultrex BME 混合并在体内植入的非转化细胞继续存活并保持分化，但通常不生长。尚未发现正常组织在这种条件下转化。例如，Sertoli 细胞存活至少一周并保留其索样结构。

Cultrex 基底膜提取物 (BME) 和 Cultrex 3D 培养基质之间有何差异

开发 Cultrex 3D 培养基质以提供用于 3D 培养的理想标准化基底膜提取物。特殊工艺用来减少生长因子。然后将该材料并入 3D 培养以验证功效。3D 培养基底膜提取物促进衍生自乳腺 (MCF-10A) 和人前列腺 (PC-3) 的人上皮细胞系分化为腺泡状结构。Cultrex 3D 培养基质 与我们的标准 Cultrex BME 基本相同，但还适用于如上述的功能性 3D 测定法。

Cultrex 基底膜提取物如何促进细胞分化？

所有上皮细胞和内皮细胞均在其至少一个表面与基底膜基质接触。通过体外为生物学线索的细胞提供天然基质作为其基材，这些细胞可以采取更为生理的形态（即，正确形状）并且启动细胞谱系特异性蛋白质表达。二维塑料平面与含血清的培养基相结合，引起细胞平坦化、增殖和去分化。

应如何储存和处理 Cultrex 基底膜提取物？

为最佳稳定性，BME 应储存在 -20°C 或以下。建议制备工作等分试样。BME 应在冰上于 4°C 过夜解冻，但不建议在 4°C 长期储存。由于冻/融循环和凝胶-液相转变可能损害产品完整性，因此应避免之。

3D 培养

什么是 3D 培养？

3D 培养是其中将永生化细胞系、原代细胞系、干细胞或组织外植体置于模拟体内细胞环境并且允许细胞在三个维度增殖的水凝胶基质（如 Cultrex 基底膜提取物）内部的体外培养。下载我们的细胞培养模型系统演变电子书副本了解更多。

3D 培养的不同类型是什么？

两种进行 3D 培养的主要方法是顶部法和嵌入法。对于顶部法，将细胞接种在 Cultrex 基底膜提取物或胞外基质蛋白的厚凝胶上。然后将一层细胞培养基薄覆盖物施加至细胞上。对于嵌入法，将细胞重悬于 Cultrex BME 或 ECM 的厚凝胶内部，并在顶部施加培养基。顶部法更易建立、更易控制接种密度及更易使细胞保持在一个焦平面内供分析。

与 3D 培养相关的变量是什么？

与 3D 培养相关的主要变量是细胞类型、细胞接种密度、水凝胶组成、水凝胶厚度、水凝胶刚度、细胞培养基的组成和培养时间。

3D 培养相对于传统 2D 培养的优势是什么？

虽然 2D 培养已用于研究细胞功能和行为的众多方面，但组织培养处理的塑料环境不同于活体内部存在的任何方面。因此，与其来源组织相比时，2D 培养物显示出改变的形态、功能、增殖和基因表达。通过置于 3D 环境下，这些细胞呈现出与体内所观察到相似的生物学和生化特征。下载我们的细胞培养模型系统演变电子书副本了解更多。

我可以怎样收获类器官或 3D 培养的细胞供后续分析？

可使用 Cultrex 类器官收获试剂盒收获类器官或 3D 培养的细胞。

在建立 3D 培养之前，应如何培养细胞？

细胞需要是健康的并在 2D 培养中活跃分裂。细胞应从深低温保存重悬后传代两次或三次，并且在每次传代期间时绝不应超过 80% 汇合度。还应使用台盼蓝评估细胞的活力，并且细胞应显示染色低于 5%。

哪种类型的分析通常适用于类器官或 3D 细胞培养？

在类器官、球状体或 3D 培养物内部， 可以评估细胞的形态、顶端/基底极性、蛋白质定位和相对增殖。此外，可以从 3D 培养物中分离细胞并评估其 RNA 表达水平和蛋白质表达水平以及 DNA 修饰情况。

什么是血管生成管形成测定？

管形成测定法基于内皮细胞在重构基底膜的水凝胶（如 Cultrex 基底膜提取物 [BME]）上培养时形成三维毛细管样管状结构的能力。

细胞侵袭/迁移测定

什么是细胞侵袭？

细胞侵袭是指细胞响应于趋化剂迁移穿过生理屏障，并且这重现了细胞在胞外基质蛋白组成的生理环境内部移动。Cultrex 细胞侵袭测定基于细胞横穿用胞外基质蛋白包被的膜的能力，评估细胞侵袭。细胞必须借助蛋白降解和细胞移动的组合横穿此屏障。

什么是细胞迁移？

细胞迁移是指细胞响应于化学刺激而移动；也称为趋化。细胞迁移测定基于细胞响应于趋化梯度横穿带 8 μm 孔的未包被膜的能力评估细胞迁移。细胞必须经历细胞骨架重塑，以卡入这些孔并自行拉伸穿过到达膜的底面。

钙黄绿素标记的侵袭性细胞是否可以传代培养？

应当对每个细胞系或模型经验地确定钙黄绿素乙酰甲酯细胞毒性。为了最佳结果，细胞应从细胞解离溶液取出并尽快置于新鲜培养基中。

与伤口愈合测定相比，Cultrex 细胞侵袭测定怎么样？

伤口愈合测定（也称刮划测定）在组织培养处理的平板上从旁监测细胞迁移。这通过以下方式实现：移除细胞或处理平板表面以防止细胞在指定区域生长，在细胞单层中生成一个空白区。该测定法测量细胞单层填充该空白区的能力，并且可以在胞外基质蛋白存在下实施。由于该测定法在一个室内部实施，故没有趋化梯度，而在无膜时，细胞不再需要改变形状并挤压通过孔洞。另一个潜在问题是，该测定法未控制细胞增殖差异。尽管伤口愈合测定法可能因补足 Boyden 室测定法而有价值，但它不替代该方法。

哪种基底膜蛋白最适合研究侵袭？

基质选择应与您想要重现的环境相对应。Cultrex  基底膜提取物将重现基底层，后者为大多数上皮源或内皮源细胞奠定基础。Cultrex 胶原蛋白 I 是结缔组织的主要组分，通常栖居有不动性细胞（如纤维细胞、脂肪细胞）和迁移性细胞（如肥大细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜酸粒细胞）。