A. 样本制备
正确制备样本为实现使用 RNAscope ISH 技术时有可能的高水平灵敏度和特异性奠定基础。ACD 原位杂交试剂盒（RNAscope、BaseScope™、miRNAscope™ 和 DNAscope™）可配合福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 的样本、新鲜冷冻 (FF) 或固定冷冻的组织以及贴壁培养和非贴壁培养的细胞使用。
ACD 网站上可提供制备上述每种样本类型用于各分析法类别（显色、荧光、多重分析、自动化）的最佳实践指南。“产品文档”的“支持”部分中存有刊载针对每种分析法详细建议样本制备过程的产品手册和相关技术说明。“支持解决方案”的“故障排除指南和常见问题解答”部分也刊载大量关于样本制备的信息。
B. 预处理
在恰当制备样本后，破解拼图的下一步便是让原位杂交探针充分抵达其靶标。这通过施加 RNAscope、BaseScope、miRNAscope 或 DNAscope 探针之前，专门化预处理妥善制备的样本来实现。不仅必须透化细胞膜以便结果最好，而且在制备固定的样本期间发生的核酸与蛋白质交联可能掩盖靶标并且必须予以解除。而在 ACD 的普及性显色 ISH 分析情况下，还需阻断内源性过氧化物酶活性。
RNAscope ISH 预处理试剂
RNAscope 预处理试剂为这些重要工作提供了合适的工具。这些试剂的专有配方已经过优化，以增强原位杂交探针跨广泛种类组织样本类抵达核酸靶标，这些样本类型包括 FFPE、新鲜冷冻 (FF) 和固定冷冻的组织以及组织微阵列 (TMA) 和培养的贴壁与非贴壁细胞。
- RNAscope 靶标修复试剂：一种缓冲液系统，随加热样本一起使用，旨在解除因组织（包括灌注过的组织）固定而发生的交联。新鲜（未固定）冷冻的组织不需要此试剂。
- RNAscope 过氧化氢试剂：配合显色试剂盒使用，阻断内源性过氧化物酶活性。
- 各种蛋白酶试剂发挥作用以透化细胞膜以及使先前交联于 RNA 靶标或 DNA 靶标的蛋白质发生适当水平蛋白水解，暴露这些靶标。
- RNAscope 蛋白酶 Plus 试剂：一种温和的蛋白酶处理，配合显色试剂盒用于 FFPE 和固定冷冻的组织。
- RNAscope 蛋白酶 III 试剂：一种温和的蛋白酶处理，配合显色试剂盒用于培养的细胞，配合荧光试剂盒用于固定冷冻的组织和培养的细胞。
- RNAscope 蛋白酶 IV 试剂：一种强效蛋白酶处理，配合显色试剂盒和荧光试剂盒用于新鲜冷冻的组织。
- RNAscope 试剂盒已经包含适合其最典型用途的预处理试剂，但试剂盒与组织的某些组合将要求额外的试剂。
- RNAscope 2.5 通用预处理试剂盒：它包含上述所有预处理试剂以覆盖最广种类的样本类型。
预处理支持
与样本制备一样， ACD 网站上可提供特定分析法类别中针对不同样本类型最佳预处理做法的综合建议。“产品文档”“支持”的部分中存有刊载针对每种分析法详细预处理实验步骤的产品手册和相关技术说明。“支持解决方案”的“故障排除指南和常见问题解答”部分也是关于如何实现宝贵样本最佳预处理的优异信息源。
C. 探针杂交
一旦已经恰当预处理妥善制备的样本，则下一块拼图涉及施加目的靶标特异性显色或荧光原位杂交探针。
RNAscope 探针杂交技术
RNAscope、BaseScope 和 DNAscope 分析采用一种涉及成对探针的探针杂交策略，成对探针的每一者含有 18 至 25 个碱基，这些碱基互补于靶标 RNA 上跟另一个探针对成员之部分相邻的部分。整个系统如此设计，从而每个探针对中两个探针必须独立地与其各自的靶序列杂交，以便后续信号放大发生。
特异性高，信噪比优异
这种配对要求不仅具有显著提高信噪比的效果，还确保高特异性基于两个不同探针结合相邻非特异性序列的概率极低。此外，我们的探针设计算法经过验证，以针对建议的分析条件范围内杂交最佳及与脱靶序列交叉杂交最少而选择。
用降解的样本或更少的可接触靶标实现单 RNA 分子检测
尽管可以通过仅三对探针与靶标结合就实现用 RNAscope 分析检测单个 RNA 靶分子，而该分析中有 20 个单独的靶标特异性探针对。这种高冗余水平意味着，甚至部分降解或非完全暴露的 RNA 靶仍可能按单分子分辨率可检出。在这方面促进 RNAscope 分析稳健性的另一个特征是要求的目标区域相对短，联合的靶序列中仅 36 至 50 个碱基就足以杂交探针对。
D. 放大和检测
最后一片拼图是生成表明存在靶分子（及其位置）的高度放大、易检测的信号，。RNAscope、BaseScope 和 DNAscope 杂交探针的独特三组分设计为能够检出单个 RNA 或 DNA 分子的灵敏度提供基础。
相邻的 Z-探针对形成放大装置的结合位点
刚才所讨论探针对的每个杂交探针与靶分子特异性且相邻结合的 18 至 25 个碱基“下游”部分借助间隔序列连接至 14 个碱基“上游”部分。间隔序列引起每个探针结构呈现“Z”形，其中，每个已结合探针对的两个上游部也相邻地线性存在。这个上游结构形成一个针对所谓预放大分子的 28 碱基结合位点。
作为对抗因非特异性结合所产生信号的额外保障，预放大分子要求两个上游部分（即，整个 28 碱基序列）连续存在才结合。
多个放大分子结合每个预放大分子；每个放大分子结合多个标记的探针
一旦与探针对的上游部分结合，则预放大分子提供一种“支架”，这种支架携有众多针对“放大分子”的结合位点，每个放大分子含有相似数目针对标记探针的结合位点，这些探针含有显色酶或荧光分子。
由结合单一分子产生的标记探针多重性使得作为 RNAscope 分析特征的巨大信号放大水平成为可能。
显微镜检测
根据所选分析的类型，通过荧光或明场显微镜分析完成检测。每个点状信号代表单一靶分子。该系统也可在合作伙伴平台（Leica Biosystems 和 Roche Tissue Diagnostics）上自动化。可通过手动计数逐细胞地定量或通过使用商业图像处理软件包自动化定量单分子信号。我们为开源图像处理程序 QuPath、ImageJ 和 CellProfiler 提供技术说明。
更多了解
以下出版物详述了 RNAscope 技术背后的核心原则：
Wang F, Flanagan J, Su N, 等人 RNAscope: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. J of Mol Diagnostics. 2012 Jan; 14(1):22-29.